Lompat ke konten Lompat ke sidebar Lompat ke footer

Laporan Praktikum Bioteknologi Tanah dan Lingkungan (Acara III)

 

ACARA III
BIOTEKNOLOGI MOLEKULER

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
    DNA adalah suatu asam nukleat yang menyimpan segala informasi biologis yang unik dari setiap makhluk hidup dan beberapa virus. Struktur kimianya berupa makromolekul kompleks yang terdiri atas 3 macam molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), asam fosfat, dan basa nitrogen. Peran utama dari molekul DNA adalah penyimpanan jangka panjang informasi. DNA sering dibandingkan dengan satu set cetak biru atau resep, atau kode, karena berisi instruksi yang dibutuhkan untuk membangun komponen lain dari sel, seperti protein dan molekul RNA. Segmen DNA yang membawa informasi genetik ini disebut gen, tetapi urutan DNA lain yang memiliki tujuan struktural, atau terlibat dalam mengatur penggunaan informasi genetik. DNA dapat mereplikasi yaitu membentuk salinan dirinya sendiri. Setiap untaian DNA berisi sekuens basis tertentu. Setiap basis juga dihubungkan oleh molekul gula dan fosfat. Bila basis membentuk anak tangga (horizontal), maka molekul gula dan fosfat membentuk bagian vertikal dari tangga tersebut.
    Teknologi manipulasi molekular dari molekul DNA dan RNA dikenal  dengan istilah rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan. Teknologi ini telah membawa perubahan yang dramatis dalam bidang bioteknologi. Dengan teknologi ini, kita dapat mengganti, menambah, atau mengurangi bagian dari molekul DNA dengan tingkat ketepatan yang tinggi dan produknya dapat diidentifikasi dengan mudah. Teknologi ini telah memungkinkan kita dapat mengisolasi, memanipulasi dan mengeksprsikan gen (menjadi protein). Industri-industri mulai tertarik untuk menghasilkan organisme tipe baru, dan sejumlah senyawa, untuk kepentingan terapi, diagnosa, proses industri, komoditi kimia, sampai ke pengolahan limbah. 

2. Tujuan Praktikum
a. Mengetahui cara isolasi DNA 
b. Mengetahui cara pengujian kualitas dan kuantitas hasi lisolasi DNA

B. Tinjauan Pustaka

    Metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (Wizard Genomic DNA Purification, Promega). Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan oleh Promega Corporation dan telah teruji hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukup besar. Metode ekstraksi DNA dengan menggunakan Kit (Promega) merupakan metode yang dikeluarkan oleh Promega Corporation beserta Kit ekstraksinya. Metode ini sudah teruji hasilnya dalam mengisolasi DNA baik secara kuantitas dan kualitas DNA yang dihasilkan. Namun kekurangan dari penggunaan Kit (Promega) dan metode ini adalah biaya yang dibutuhkan cukup besar.Hasil isolasi DNA dengan menggunakan Kit Ekstraksi DNA (Promega) mampu menghasilkan isolat DNA genom yang berukuran besar dan berkualitas baik. Namun selain DNA juga masih terdapat smear yang nampak di atas dan di bawah pita DNA genom (Mulyani et al, 2011).
    Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA.  Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl (Mulyani et al., 2011), metode SDS , dan metode fenol kloroform. Seiring perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, ektraksi DNA dapat dilakukan menggunakan kit dari berbagai merk (Fitriya, 2015).
    Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan dan purifikasi fragmen DNA, RNA, atau protein. Prinsip dasar dari elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatan listrik intrinsik. Elektroforesis DNA biasanya digunakan untuk  memisahkan DNA berdasarkan perbedaan ukurannya. Pemisahan DNA dalam hal ini adalah menggunakan gel agarosa. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Ukuran pori agarosa sesuai untuk pemisahan polimer asam nukleat yang tersusun dari ratusan nukleotida. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNAmenurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibandingkan dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan dengan gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif. Metode elektroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam tejnik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah (Langga, 2012).
    Visualisasi DNA dilakukan dengan elektroforesis pada bak elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1% gel agarosa. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam bufer 1X TAE dan dipanaskan dalam microwave selama ± 30 detik sampai tercampur homogen. Setelah itu larutan agarosa ditunggu sampai suhunya ± 60C dan kemudian ke dalam larutan agarosa ditambahkan ethidium bromida dengan konsentrasi 0,12 µg/ml agar DNA dapat divisualisasi dibawah sinar ultraviolet. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam bak elektroforesis yang sebelumnya telah dipasang sisir cetakan dan ditunggu sampai menjadi keras (15-20 menit). Elektroforesis dilakukan selama 90 menit pada tegangan 55 volt (lama waktu running tergantung pada konsentrasi gel dan voltase). Setelah elektroforesis, DNA divisualisasi di bawah sinar ultraviolet dalam ruang gelap dan diambil gambarnya dengan menggunakan Gel Doc 2000 yang menggunakan filter merah (Lelana, 2007).
Elektroforesis gel agarosa merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam proses elektroforesis merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam laju migrasi DNA untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan berat molekul fragmen DNA. Molekul DNA berbanding terbalik dengan konsentrasi gelnya yaitu konsentrasi gel agarosa yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band yang dekat ukurannya. Penggunaan gel dengan konsentrasi yang berbeda, dapat menghasilkan perbedaan ukuran. 

C. Metodologi Praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum
    Praktikum Bioteknologi Tanah dan Lingkungan acara III Bioteknologi Molekuler dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 21 Desember 2017 pukul 10.30 WIB di Laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. 

2. Alat 
Autoclave
- Mortar dan Pestle
- Centrifuge
- Waterbath

3. Bahan
- Sampel
- Buffer Ekstraksi berbasis CTAB
- Isopropanol
- Chlorofom
- Sodium asetat

4. Cara Kerja
1. Isolasi DNA
a) Isolasi Tanaman
Teknik isolasi ini merupakan teknik isolasi DNA dari Nandariyah (2007) yang telah dimodifikasi
1. Ambil sampel daun dan pisahkan dari tulang daun
2. Timbang sampel daun seberat 200 mg
3. Tambahkan Buffer ekstraksi sebanyak 1 ml ke dalam plastik klip dan masukkan 200 mg sampel daun
4. Simpan daun ke dalam freezer pada suhu -20 C selama 24 jam
5. Lumatkan sampel sampai halus
6. Pindahkan sampel  dalam tabung steril
7. Tambahkan 500 µl larutan ekstraksi dan diinkubasikan pada suhu 650 C selama 60 menit
8. Tambahkan 700 µl chloroform, campur hingga homogen
9. Centrifugasi pada kecepatan 12.000 RPM selama 10 menit
10. Ambil cairan lapisan atas, pindahkan ke tabung baru (50 ul)
11. Tambahkan 650 µl (minimal 1:1 dengan volume) isopropanol dingin, dan tambahkan 2,5 M sodium Asetat (1/10 dari volume), campur hingga homogen (menggunakan vortex).
12. Centrifugasi pada kecepatan 13.000 RPM selama 5 menit.
13. Buang supernatant, pellet dicuci dengan Ethanol dingin 70 %
14. Keringkan pellet DNA dengan kering angin 
15. Larutkan DNA 200 ul TE
16. Simpan dalam -20 0 C 
    b) Pembuatan Gel untuk Uji Hasil Analisis Produk DNA dan PCR dan Pelaksanaan Elektroforesis
Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis. Elektroforesis dapat menggunakan agarosa ataupun puliacrilamid sebagai bahan gel. Berikut ini langkah-langkah dalam pengujian kualitas menggunakan agarosa:
1. Masukkan  100 ml TBE ke dalam erlenmeyer
2. Tambahkan 1 mg agarosa ke dalam erlenmeyer
3. Panaskan diatas magnetig stirrer sampai mendidih
4. Matikan pengatur suhu pada magnetig stirrer lalu setelah dingin tambahkan 5 ul Etidium Bromide
5. Masukkan campuran Agarose dan TBE tadi ke dalam cetakan elektroforesis dan tunggu sampai mengeras
6. Masukkan sampel DNA 5 ul yang telah dicampur 1 ul loading dye ke dalam sumuran DNA
7. Hidupkan elektroforesis dengan tegangan 80 
8. Tunggu sampai DNA bergerak kurang lebih ¾ dari panjang gel agarose

    c) Gel Dokumentasi
Uji kuantitas DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil isolasi DNA ditembak sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm, dan kemudian dapat dilakukan penghitungan untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA. Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis, DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada ⋋ 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada ⋋ 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur rumus :
1. Hidupkan Spektrofotometer
2. Masukkan 5 µl sampel DNA
3. Tambahkan 1995 µl alcohol 70 %
4. Hitung nilai absorbansi denga npanjang gelombang 260 nm dan 280 nm
5. Hitung konsentrasi dan kemurnian DNA dengan rumus :
Kemurnian DNA = Å260/Å280
Konsentrasi DNA = Å260 x 50 x faktor pengenceran
Å260 = Nilai absorbansi pada ⋋ 260 nm
Å280 = Nilai absorbansi pada ⋋ 280 nm
50   = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

Untuk mendapatkan hasil & pembahasan lengkap secara gratis : Hubungi SUPERMIPA sekarang!! 


DAFTAR PUSTAKA
Fitriya, TR., Muslimin I, dan Lisa Lisdiana. 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA Kit dan CTAB/NaCL yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan  Shigella dysentriae. Jurnal LenteraBio 4(1):87-92
Langga, Indah F., M Restu, dan Tutik Kuswinanti. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi dalam Ekstrasi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi 12(3):265-276
Lelana, Neo E., Sutarno, dan Nita Etikawati. 2007. Identifikasi Polimorfisme pada Fragmen ND-5 DNA Mitokondria Sapi Benggala dan Madura dengan Teknik PCR-RFLP. Jurnal Biodiversitas 4(1):1-6
Mulyani, Yuniar., Agus Purwanto, dan Isni Nurruhwati. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini KOI HERPES VIRUS (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Jurnal Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran 
Novitasari, DA. 2014. Teknik Isolasi Dan Elektroforesis Dna Total Pada Kryptopterus Apogon (Bleeker 1851) Dari Sungai Kampar Kiri Dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM 1 (2) :  258-261
Pakpahan, EF. 2015. Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% Dan 1,2% Pada Elektroforesis Dna Mycobacterium Tuberculosis. J Kesehatan Rajawali 5 (9) : 19-23
Yoccoz, NG et al. 2012. DNA From Soil Mirrors Plant Taxonomic And Growth Form Diversity. J Molecular Ecology 21 : 3647-3655

Posting Komentar untuk "Laporan Praktikum Bioteknologi Tanah dan Lingkungan (Acara III) "